声明

本文是学习GB-T 13091-2018 饲料中沙门氏菌的测定. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们

1 范围

本标准规定了饲料中沙门氏菌的检验方法。

本标准适用于饲料和饲料添加剂中沙门氏菌的检验。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 培养基或材料

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。

3.1 水：应符合 GB/T 6682 中三级水的要求。

3.2 缓冲蛋白胨水(BPW): 见附录 B 中 B.1。

3.3 氯化镁孔雀绿(RV) 增菌液：见附录 B 中 B.2。

3.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC) 增菌液：见附录 B 中 B.3。

3.5 亚硫酸铋(BS) 琼脂：见附录 B 中 B.4。

3.6 胆硫乳(DHL) 琼脂：见附录B 中 B.5。

3.7 沙门氏菌属显色培养基。

3.8 营养琼脂(NA): 见附录 B 中 B.6。

3.9 三糖铁琼脂(TSI): 见附录 B 中 B.7。

3.10 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 B 中 B.8。

3.11 尿素琼脂(pH 7.2):见附录 B 中 B.9。

3.12 氰化钾(KCN) 培养基：见附录 B 中 B.10。

3.13 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 B 中 B.11。

3.14 糖发酵管：见附录 B 中 B.12。

3.15 邻硝基酚β-D 半乳糖苷(ONPG) 培养基：见附录 B 中 B.13。

3.16 半固体琼脂：见附录 B 中 B.14。

3.17 丙二酸钠培养基：见附录 B 中 B.15。

3.18 沙门氏菌因子 O 和 H 多价诊断血清，Vi 因子诊断血清。

4 仪器设备

4.1 冰箱：2℃~5℃。

4.2 恒温培养箱：36℃±1℃,42℃±1℃。

4.3 均质器。

4.4 振荡器。

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4.5 电子天平：感量0.1 g。

4.6 无菌锥形瓶：容量500 mL、250mL, 或无菌均质袋。

4.7 无菌吸管：1 mL (具0.01 mL 刻度)、10 mL (具0. 1 mL
刻度)或微量移液器及吸头。

4.8 无菌培养皿：直径60 mm,90 mm。

4.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。

4.10 pH 计或pH 比色管或精密 pH 试纸。

4.11 全自动微生物生化鉴定系统。

5 样品

5.1 采样原则

样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程应遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来

污染。

5.2 采样方法

5.2.1
应在同一批次产品中采集样品，每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求，
一般不少于

500 g(mL)。

5.2.2 独立包装不大于500 g 的固态产品或不大于500 mL
的液态产品，取完整包装。

5.2.3 独立包装大于500 mL
的液态产品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均匀后采集
适量样品，放入无菌采样容器内作为一件样品。

5.2.4 独立包装大于500 g
的固态产品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放
入同一个无菌采样容器内作为一件样品。

5.3 采集样品的贮存和运输

5.3.1 应尽快将样品送往实验室检验。

5.3.2 应在运输过程中保持样品完整。

5.3.3
应在接近原有贮存温度条件下贮存样品，或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化。

6 试验方法(试验程序图见附录 A)

6.1 前增菌

无菌条件下称取25 g(mL) 样品，加入装有225 mL 灭菌BPW 的500 mL
无菌锥形瓶内，置于振荡 器中，以8000 r/min～10000r/min 振荡2 min～3min;
若样品为液态，振荡混匀即可。36℃±1℃培

养18 h±2 h。

注：可用无菌均质袋代替锥形瓶，然后用均质器拍打2
min～3min,但有坚硬或棱角的样品不能够使用均质袋，只
能使用锥形瓶，以防均质和增菌过程中均质袋破裂泄漏，造成污染。

6.2 选择性增菌

前增菌培养物摇匀后，取1 mL 接种于装有10 mLRV 的试管中，于42℃±1℃培养18
h～24 h。

另取前增菌培养物1 mL, 接种于装有10 mLSC 的试管中，36℃±1℃培养18 h～24 h。

6.3 分离培养

用接种环取1环选择性增菌液，划线接种于BS 琼脂平板上，于36℃±1℃培养40
h～48 h。另取

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1环选择性增菌液，划线接种于DHL
琼脂平板或沙门氏菌显色培养基平板上，36℃±1℃培养18 h~

24h, 观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌在各个平板上的菌落特征见表1。

表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

6.4 生化试验

6.4.1
从选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于
底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养
18h～24h, 必要时可延长至48h。
三糖铁琼脂培养基特征变化见表2。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶

试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表3。

表 2 三糖铁培养基特征变化表

表 3
沙门氏菌属在三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

6.4.2
接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、
尿素琼脂(pH7.2)、 氰化钾(KCN)
培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接

种。于36℃±1℃培养18 h～24h, 必要时可延长至48 h。
将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室

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温至少保留24 h,以备必要时复查。

表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

根据表4对结果进行判定，具体如下：

a) 反应序号 A1: 典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN
和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异

常，按表5可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。

表 5 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

b) 反应序号A2:
补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体的两项试验结果均为阳性，
但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

c) 反应序号A3: 补做ONPG 试验。 ONPG
阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤
寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

d) 必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。

表6 沙门氏菌属各生化群的鉴别

6.4.3
如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据6.4.1的初步判断结果，从营养琼

脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生

化鉴定系统进行鉴定。

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6.5 血清学鉴定

6.5.1 检查培养物有无自凝性

采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应，在洁净的玻片
上滴加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水内，使成为均一性的混浊悬液，将玻片轻轻摇动
30
s～60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集，即认为有自凝性，

反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。

6.5.2 0抗原的鉴定

在玻片上划出2个约1 cm×2cm
的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，
在其中一个区域下部加1滴多价菌体 O
血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无
菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min,
并对着暗背景进 行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 O
血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(2%~
3%)细菌培养基上再检查；如果因Vi 抗原的存在而阻止了O
凝集反应，可挑取菌苔于1 mL 生理盐水

中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。

6.5.3 H 抗原的鉴定

操作同6.5.2。H
抗原发育不良时，将菌株接种在0.55%～0.65%半固体琼脂平板的中央，待菌落
蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过接种装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小玻管1次~

2次，自远端取菌培养后再检查。

6.5.4 Vi 抗原的鉴定

操作同6.5.2。用Vi 因子血清检查。

7 结果表示

综合以上生化试验和血清学试验的结果，得出25 g(mL)
样品中检出或未检出沙门氏菌。

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附 录 A

(规范性附录)

试验程序图

沙门氏菌试验程序见图 A.1。

style="width:12.25344in;height:11.26686in" />25 g(mL)样品+225 mL BPW

36℃±1℃,18h=2h

1mL+RV 10 ml 1ml+SC10 ml

42℃=1℃,18 h\~~24 h 36℃=1℃,18 h …24 h

BS平板 DHL.平板(或显色培养基)

36℃±1℃,40 h～48 h 36℃=1℃,18 h 24 h

挑取可疑菌落

ISI、 赖氨酸脱羧酶、 NA 平板、靛基质、 KCN、 尿素(pH7.2)

生化鉴定试剂盒 或全自动微生物 生化鉴定系统

H₂S+ 靛基质-

尿素 -KCN—

赖氨酸+

H.S+ 靛基质-

尿素-KCN-

赖氨酸一

H,S+ 靛基质一

尿素-KCN+

赖氨酸十

style="width:0.12004in;height:0.12672in" />

沙门氏菌

IV/V 群

生化试验

H,S+ 靛基质一

尿素+KCN—

赖氮酸十

甘篱醇+

山梨醇+

沙门氏菌

非沙门氏菌

血清学试验

报告

图 A.1 试 验 程 序 图

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附 录 B

(规范性附录)

培养基和试剂的制备及试验方法

B.1 缓冲蛋白胨水(BPW)

B.1.1 成分

B.1.2 制备

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min,煮沸溶解，调节 pH
至7.2±0.2,121℃高压灭 菌20 min,临用时分装在500 mL 瓶中，每瓶225 mL,
或配好后校正 pH, 分装于500 mL 瓶中，每瓶

225 mL,121℃高压灭菌，20 min 后备用。

B.2 氯化镁孔雀绿(RV) 增菌液

B.2.1 溶液 A

B.2.1.1 成分

蛋白胨 5.0 g

氯化钠 8.0 g

KH₂PO 1.6 g

蒸馏水 1000 mL

B.2.1.2 制备

将各成分加入蒸馏水中，加热至约70℃溶解，调节 pH 至7.0此溶液需当天使用。

B.2.2 溶液 B

B.2.2.1 成分

氯化镁(MgCl₂ ·6H₂O) 400 g

蒸馏水 1000 mL

B.2.2.2 制备

将 MgCl₂ ·6H₂O 溶于水中。

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B.2.3 溶液 C

B.2.3.1 成分

孔雀绿 0.4 g

蒸馏水 100 mL

B.2.3.2 制备

将孔雀绿溶于水中。溶液可室温保存于棕色玻璃瓶中。

B.2.4 完全培养基

B.2.4.1 成分

溶液 A 1000 mL

溶液 B 100 mL

溶液 C 10.0 mL

B.2.4.2 制备

按上述比例配制，调节pH, 使灭菌后pH 为5.2,分装于试管中，每管10 mL。115℃
高压灭菌15 min。

冰箱保存。

B.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC) 增菌液

B.3.1 基础液

B.3.1.1 成分

胰蛋白胨

乳糖

磷酸氢二纳(Na₂HPO₄ · 12H₂O)

亚硒酸氢钠

蒸馏水

B.3.1.2 制备

溶解前三种成分于水中，煮沸5

B.3.2 L-胱氨酸溶液

B.3.2.1 成分

L-胱氨酸

1 mol/L氢氧化钠溶液

5.0 g

4.0 g

10.0 g

4.0 g

1000 ml

min, 冷却后，以无菌操作加入亚硒酸氢钠。

0.1 g

15.0 mL

B.3.2.2 制备

在灭菌条件下，用灭菌水将上述成分稀释到100 mL, 无须蒸汽灭菌。

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B.3.3 完全培养基制备

基础液 1000 mL

L-胱氨酸溶液 10.0 mL

基础液冷却后，以无菌操作加入L-胱氨酸溶液，调节 pH
至7.0±0.2后将培养基分装于适当容量

的试管中，每管10 mL。

注：培养基在配制当日使用。

B.4 亚硫酸铋(BS) 琼脂

B.4.1 成 分

B.4.2 制备

将前三种成分加入300 mL 蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20
mL 和 30mL 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20 mL 和30 mL
蒸馏水中，琼脂加入600 mL
蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基
础液中，混合均匀，将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节
pH 至7.5±0.2,随即

倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。

注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48
h 会降低其

选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。

B.5 胆 硫 乳(DHL) 琼 脂

B.5.1 成 分

蛋白胨

牛肉浸膏

乳糖

蔗糖

去氧胆酸钠

硫代硫酸钠

柠檬酸钠

柠檬酸铁铵

20.0 g

3.0 g

10.0

10.0

1.0 g

2.3 g

1.0 g

1.0 g

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中性红

琼脂

蒸馏水

0.03 g

18.0 g～20.0 g

1000 mL

B.5.2 制备

将除中性红和琼脂以外的成分溶解于400mL 蒸馏水中，调节pH
至7.3±0.2,再将琼脂于600 mL

蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，加入0.5%中性红溶液6 mL,
待冷却至50℃~55℃,倾注平皿。

B.6 营养琼脂(NA)

B.6.1 成分

牛肉浸膏 3.0 g

蛋白胨 5.0 g

琼脂 9.0 g～18.0 g

蒸馏水 1000 mL

B.6.2 制备

将上述各成分煮沸溶解，调节 pH 至7.2～7.4,121℃高压灭菌20 min。

B.6.3 平皿制备

将制备的营养琼脂在水浴锅里溶解，冷却至50℃~55℃时，倾注入灭菌平皿中，每皿约15
mL。

B.7 三糖铁琼脂(TSI)

B.7.1 成分

牛肉浸膏 3.0 g

酵母浸膏 3.0 g

蛋白胨 20.0 g

氯化钠 5.0 g

乳糖 10.0 g

蔗糖 10.0 g

葡萄糖 1.0 g

柠檬酸铁 0.3 g

硫代硫酸钠 0.3 g

酚红 0.024 g

琼脂 12.0 g～18.0 g

蒸馏水 1000 mL

B.7.2 制备

将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节 pH
至7.4±0.1,加入琼脂，加热煮沸，以溶化
琼脂，再加入酚红，摇匀，分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层，121℃高压灭菌20
min,放置高

层斜面备用。

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B.8 蛋白胨水、靛基质试剂

B.8.1 蛋白胨水

B.8.1.1 成分

蛋白胨(或胰蛋白胨) 20.0 g

氯化钠 5.0 g

蒸馏水 1000 ml

B.8.1.2 制备

将上述成分加入蒸馏水，煮沸溶解，调节 pH
至7.4±0.2,分装小试管，121℃高压灭菌15 min。

B.8.2 靛基质试剂

B.8.2.1 柯凡克试剂：将5 g 对二甲氨基甲醛溶解于75 mL
戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25 mL。

B.8.2.2 欧-波试剂：将1 g 对二甲氨基甲醛溶解于95 mL95%
乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20 mL。

B.8.3 试验方法

挑取小量培养物接种，在36℃±1℃培养1 d～2d, 必要时可培养4 d～5d。
加入柯凡克试剂约 0.5mL,
轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5 mL,
沿管壁流下，覆盖于培养液

表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

B.9 尿素琼脂(pH 7.2)

B.9.1 基础液

B.9.1.1 成分

蛋白胨 1.0 g

葡萄糖 1.0g

氯化钠 5.0 g

磷酸二氢钾 2.0 g

酚红 0.012 g

琼脂 12.0 g～18.0 g

蒸馏水 1000 mL

B.9.1.2 制备

将上述成分溶于水中，煮沸，调节 pH 至7.2±0.2,121℃高压灭菌20 min。

B.9.2 尿素溶液

B.9.2.1 成分

尿素 400 g

蒸馏水 加至1000 mL

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B.9.2.2 制备

将尿素溶于水中，通过滤器除菌，并应检查灭菌情况。

B.9.3 完全培养基制备

基础液 950 mL

尿素溶液 50 mL

在无菌条件下，将尿素溶液加到事先溶化并冷却至45℃基础液中，分装试管，放置成斜面备用。

B.9.4 试验方法

挑取琼脂培养物接种，在36℃±1℃培养24
h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变

为红色。

B.10 氰化钾(KCN) 培养基

B.10.1 成分

蛋白胨

氯化钠

磷酸二氢钾

磷酸氢二钠

蒸馏水

0.5%氰化钾

B.10.2 制备

10.0 g

5.0 g

0.225 g

5.64 g

1000 ml

20.0 mL

将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121℃高压灭菌15 min。
放在冰箱内使 其充分冷却。每100 mL 培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0 mL
(最后浓度为1:10000),分装于无菌试 管内，每管约4 mL,
立刻用无菌橡皮塞塞紧，放在4℃冰箱内，至少可保存2个月。同时，将不加氰化钾

的培养基作为培养基，分装试管备用。

B.10.3 试验方法

将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾(KCN)
培养基。并另挑取 1环接种于对照培养基。在36℃±1℃培养1 d～2d,
观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经

2d 细菌不生长为阴性(抑制)。

注： 氰化钾是剧毒物，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，
氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环

节都要特别注意。

B.11 赖氨酸脱羧酶试验培养基

B.11.1 成分

蛋白胨

酵母浸膏

5.0 g

3.0 g

葡萄糖

蒸馏水

1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液

L-赖氨酸或 DL- 赖氨酸

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1.0 g

1000 mL

1.0 mL

0.5 g/100 mL或1.0 g/100 mL

B.11.2 制备

将除赖氨酸以外的成分加热溶解后，每瓶100 mL 分装，分别加入赖氨酸。 L-
赖氨酸按0.5%加入， DL- 赖氨酸按1%加入。调节 pH
至6.8±0.2,对照培养基不加入赖氨酸。分装于无菌小试管内，每管

0.5mL, 上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10 min。

B.11.3 试验方法

从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36℃±1℃培养18 h～24h,
观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者
由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为

黄色。

B.12 糖发酵管

B.12.1 成分

牛肉膏 5.0 g

蛋白胨 10.0 g

氯化钠 3.0 g

磷酸氢二钠(含12个结晶水) 2.0 g

0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12.0 ml

蒸馏水 1000 mL

B.12.2 制备

B.12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节 pH
至7.4±0.2。按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个

倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15 min。

B.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100 mL,121℃
高压灭菌15 min 。 另将各 种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5 mL
糖溶液加入于100 mL 培养基内，以无菌操作分装

小试管。若蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

B.12.3 试验方法

从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36℃±1℃培养， 一般2 d～3d。
迟缓反应需观察14 d~

30 d。

B.13 邻硝基酚β-D 半乳糖苷(ONPG) 培养基

B.13.1 成分

邻硝基酚β-D 半乳糖苷(ONPG)(O-Nitrophenyl- β-D-galactopyranoside) 60.0
mg

0.01 mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.5) 10.0 mL

1%蛋白胨水(pH 7.5) 30.0 mL

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B.13.2 制备

将 ONPG
溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管0.5
mL, 用

橡皮塞塞紧。

B.13.3 试验方法

自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于36℃±1℃培养1h～3h 和24 h
观察结果。如果β-半乳

糖苷酶产生，则于1 h～3h

B.14 半固体琼脂

B.14.1 成分

牛肉膏

蛋白胨

氯化钠

琼脂

蒸馏水

变黄色，如无此酶则24 h 不变色。

0.3 g

1.0 g

0.5 g

0.35 g～0.4 g

100 mL

B.14.2 制备

将上述成分溶于水中，煮沸溶解，调节 pH
至7.4±0.2,分装小试管，121℃高压灭菌20 min。 直立

凝固备用。

注：供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验用。

B.15 丙二酸钠培养基

B.15.1 成分

B.15.2 制备

除指示剂以外的成分溶解于水，调节 pH
至6.8±0.2,再加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌

15 min。

B.15.3 试验方法

用新鲜的琼脂培养物接种，于36℃±1℃培养48
h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。

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